1、引物設(shè)計:pcr引物設(shè)計的基本原則有哪些

2、引物設(shè)計:引物設(shè)計原則是什么?

引物設(shè)計有3條基本原則： · · 關(guān)注微信公眾號：挪車小黃碼 · 官方免費領(lǐng)取：挪車碼，車主雙方虛擬號碼，隱私保護，拒絕騷擾，違章查詢，免費使用！--挪車電話 官網(wǎng)：https://www.nuoche.cc/ · ·

首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯配)。

具體實現(xiàn)這3條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primerlength），產(chǎn)物長度（proctlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internalstability,用?G值反映)。

形成引物二聚體(primerdimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（plexformationandhairpin）的能值，在錯配位點（falseprimingsite）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點，引進突變等。

一、引物與模板的序列要緊密互補。

二、引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

三、再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯配)。

3、引物設(shè)計:引物設(shè)計原則是什么？

引物設(shè)計原則是：

1、引物長度一般為15-，常用的為18-，但不能大于。

2、引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近。

3、引物所對應(yīng)的模板序列的Tm值**在72℃左右，至少要在55-80℃之間，Tm值曲線以選取72度附近為佳，5'到3’的下降形狀也有利于引物與模板的結(jié)合。

4、ΔG值（自由能）反應(yīng)了引物與模板結(jié)合的強弱程度，3'端的ΔG值相對要低，且**值不要超過9，否則不利于正確引發(fā)反應(yīng)，3'末端雙鏈的ΔG值在0--2kcal/mol時，PCR產(chǎn)量幾乎達到百分之百，但在－6時只達到40%，－8時少于20%，－10時接近于0。

5、錯配率一般不要超過，否則會出現(xiàn)非目的條帶。但對于某些特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發(fā)效率為以上，而在錯誤位點的引發(fā)效率為，并且不好找到其他更合適的引物，那么這對引物是可以接受的。

4、引物設(shè)計:引物設(shè)計中的F、R表示什么?

正向引物，反向引物。

引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列。連續(xù)互補的堿基應(yīng)該要少于4個。引物應(yīng)使其G值不要太高，G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。

引物長度和GC含量要適中。引物長度大概為18~，但不應(yīng)大于，引物過短會影響到擴增的特異性，太長的話其延伸溫度將會大于74℃，不利Taq酶的催化反應(yīng)。若擴增產(chǎn)物為4~5kb，引物**不要少于。

注意事項：

1、引物的長度一般為15-30?bp，常用的是18-27?(22)bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq?DNA聚合酶進行反應(yīng)。?

2、堿基要隨機分布：引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)（False?priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布**是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

3、3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，如GGG或CCC，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。

4、引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。